氮吹儀在測(cè)定保健酒中總皂苷含量

  保健酒（Liqueurs）是由基酒加中藥配制而成，具有抗疲勞，調(diào)節(jié)免疫力之功效。保健酒將中藥功能與酒的作用有效結(jié)合，極大地增強(qiáng)了藥物的效能與作用，藥借酒勢(shì)，酒助藥威，迅速增強(qiáng)人體微循環(huán)（擴(kuò)張毛細(xì)血管），使有效成分直達(dá)病灶，諸多癥狀可迅速得到緩解或消失。保健酒的生物活性成分通常來(lái)自傳統(tǒng)中藥，特別是有滋補(bǔ)作用的中藥?？傇碥占礊楸＝【浦兄匾墓πС煞?，“皂苷”是由甾體或三萜類(lèi)化合物作為苷元與糖分子縮合而成的一類(lèi)低聚糖苷，是一類(lèi)廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)化合物，它具有調(diào)節(jié)腎臟功能，抗缺氧和抗疲勞、抗低溫應(yīng)激作用、抗脂質(zhì)氧化作用、抗致突變作用及雙向調(diào)節(jié)免疫的保健功能?？傇碥盏默F(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為2003 版《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，該法是針對(duì)保健食品中“總皂苷”含量測(cè)定的一個(gè)廣泛方法。皂苷結(jié)構(gòu)中的糖基本身可與香草醛發(fā)生顯色反應(yīng)，保健酒中含有多種不同糖基數(shù)的皂苷致使與香草醛出現(xiàn)顯色結(jié)果差異。為消除糖基對(duì)香草醛顯色劑的干擾，本研究在衛(wèi)生部方法的基礎(chǔ)上將保健酒中皂苷水解成不含有糖基的苷元再與硫酸-香草醛顯色，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)保健酒樣中總皂苷含量的目的。

材料與方法

材料、儀器及試劑

  供試品與對(duì)照品：保健酒A，海南椰島酒業(yè)發(fā)展有限公司提供；人參皂苷Re，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

  儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)；十萬(wàn)分之一分析天平；萬(wàn)分之一天平；漩渦混懸器；固相萃取儀；隔膜真空泵；氮吹儀；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。移液槍?zhuān)凰芰想x心管；50 mL圓底燒瓶；巴氏吸管；固相萃取柱(bond Elut-C18 OH，500 mg 3 mL，50/PK，Agilent Technologies)。試劑耗材：香草醛（基準(zhǔn)試劑）二氯甲烷、甲醇、乙腈、硫酸、鹽酸為分析純；77 %硫酸溶液（v/v）；lv化氫水溶液（4 mol/L）；70 %甲醇水溶液（v/v）。香蘭素硫酸顯色中間液：準(zhǔn)確吸取8 %香蘭素甲醇溶液500 μL 加入3000 μL 的77 %硫酸溶液中，振蕩混合均勻，冷卻至室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用。

實(shí)驗(yàn)方法

對(duì)照品溶液的制備

皂苷苷元溶液的制備

  精密稱(chēng)取人參皂苷Re 適量，用甲醇定容，配制成人參皂苷Re 對(duì)照品溶液（4 mg/mL），精密移取500 μL 的乙腈于塑料離心管中，加入鹽酸（4 mol/L）500 μL，渦旋混勻得到水解溶劑，再往其中加入4 mg/L 的Re 對(duì)照品溶液1 mL，渦旋混勻后放入80 ℃恒溫水浴3 h，冷卻后加入5 mL 的二氯甲烷和3 mL的去離子水，有機(jī)相用3 mL水洗兩遍，分離去掉水層(上層)。二氯甲烷有機(jī)相層經(jīng)氮吹儀吹干，用2 mL 乙腈溶解，得到濃度為1.0 mg/mL 的人參皂苷苷元溶液。

苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液

  分別準(zhǔn)確吸取苷元溶液（1.0 mg/mL）75 μL、150 μL、300 μL、600 μL 于刻度試管中，用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，得到濃度為0.075 mg/mL、0.15 mg/mL、0.30 mg/mL、0.60 mg/mL 的苷元標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

顯色

  分別準(zhǔn)確吸取濃度為0.075 mg/ mL、0.15 mg/ mL、0.30 mg/ mL、0.60 mg/ mL的苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液500.0 μL加入到4.5 mL的香草醛硫酸顯色中間溶液中，渦旋混勻，同時(shí)吸取500.0 μL的乙腈按照上述步驟操作，得到溶劑空白顯色組。所得混合物于70 ℃水浴加熱10 min 后迅速放入冰水中冷卻30 s，檢測(cè)溶液在541 nm（掃描大吸收波長(zhǎng)）波長(zhǎng)下的吸光度, 每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

供試品溶液的制備

皂苷提取

  準(zhǔn)確吸取1.0 mL 保健酒A于瓷蒸發(fā)皿中，水浴揮干乙醇和水，所得固體用1.0 mL 水溶解，備用。將此樣品溶液加入經(jīng)激活的萃取小柱中，然后用6 mL去離子水洗滌，保持1～2 滴/s 的速度除去樣品中的糖類(lèi)物質(zhì)。再分別用70 %甲醇水溶液（6 mL）和甲醇(10 mL)進(jìn)行洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶中。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去甲醇和水，所得固體用甲醇1.0 mL溶解備用。

水解

  精密移取500 μL 的乙腈于15 mL 塑料離心管中，加入鹽酸500 μL，渦旋混勻得到水解溶劑，加入上述酒樣甲醇溶液1 mL，渦旋混勻后放入80 ℃恒溫水浴3 h，冷卻至室溫后加入5 mL 的二氯甲烷和3 mL的去離子水，有機(jī)相用3 mL水洗兩遍，分離去掉水層(上層)。二氯甲烷有機(jī)相層經(jīng)氮吹儀吹干，用2 mL乙腈溶解得到酒樣水解的苷元溶液。

顯色

  分別準(zhǔn)確吸取500.0 μL酒樣苷元乙腈溶液加入到4.5 mL 的香草醛-硫酸顯色中間溶液中，混合均勻，所得混合物于70 ℃水浴中加熱10 min 后，迅速放入冰水中冷卻30 s，上機(jī)測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定2 次。

討論

  本實(shí)驗(yàn)將保健酒A中的皂苷水解成苷元，消除了糖基對(duì)香草醛顯色劑的干擾，采用液液萃取方式提取苷元的同時(shí)除去了酒樣中的干擾色素。實(shí)驗(yàn)采用皂苷酸水解顯色法測(cè)定保健酒A中的總皂苷含量，以水解后的人參皂苷苷元制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。此改良法具有范圍線(xiàn)性良好、準(zhǔn)確度高、度好、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合用于保健酒中總皂苷含量的定量分析和質(zhì)量控制。